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新一代高通量测序技术(NGS)漫谈:从古格陵兰到当代法庭
2018-04-25 14:34  来自: 天津市司法局

  天津华大法医物证司法鉴定所 付 晓

  二十世纪三大科学工程之一——人类基因组计划(human genome project, HGP)是人类探索生命奥秘,破译遗传密码的前所未有的重大里程碑事件。HGP不仅解开了人体内约2.5万个基因的遗传密码,还催生了以新一代测序(Next Generation Sequencing, NGS)为代表的一大批新事物和新技术,帮助基因组学理论得以迅速实践和大规模应用转化,极大地推进疾病诊断、生物制药、生物化工等领域研究和应用进程。那么对于法医遗传科学这一古老而又年轻的学科来说,NGS技术是否能像其在医学基因组科学领域大放异彩呢?法医遗传学又是如何从几千年前的“滴血认亲”,发展到现在的STR/SNP基因序列分析的呢?本文将会对以上问题进行简要的回顾和介绍。

  一、来自四千年前的“照片”:古人类,新历史

  丹麦哥本哈根大学的EskeWillerslev教授是一位古基因组和进化领域的著名研究者。为了研究古人类进化图谱,他一直都在苦苦寻找古人类留下的身体组织样本,为此曾多次深入北极永久冻土带,却都无功而返。2008年的某天,他在丹麦自然历史博物馆中偶然发现了少许在格陵兰采集的古人类头发样本,在1986年被工作人员带回丹麦之前,它们已在永久冻土带中沉睡了约4000年。受制于当年的技术水平,它们无法作为分析材料进行研究,所以一直静静躺在博物馆中鲜有人问津。

  EskeWillerslev教授意识到,这些被“雪藏”、受“冷遇”的样本正是他梦寐以求的古人类身体组织样本——它们受到的污染极少,正是可分析古代人类基因组的良好材料。

  EskeWillerslev团队和他来自中国深圳华大基因研究院的同事们立即着手对这些格陵兰岛古人毛发样本开展研究。在新一代高通量测序技术(High-Throughput Sequencing,又名下一代或二代测序Next Generation Sequencing,NGS)帮助下,一幅石器时代古格陵兰人的神秘“照片”向我们徐徐展开:他,英年早逝,粗短身材,深色皮肤,褐色眼睛,铲状门牙,Rh阳性A型血,深褐色粗发,已开始斑秃;酒精耐受度高,产生尼古丁依赖的危险比常人高——幸好数千年后人类才学会吸烟。他就是曾出现在格陵兰岛上的萨卡克人,不是今天生活在附近地区的爱斯基摩人和北美土著人的先祖,而是与东西伯利亚的楚克其人有亲缘关系。研究人员认为,他们可能是在约5500年前渡过白令海峡,穿过阿拉斯加和加拿大,之后在格陵兰岛定居下来,也许是气候的原因,也许是在与其他种族和文化的竞争中败北,他们最终永远消失在这片茫茫冰原。

  给4000年前的古人类精确画像——这是世界首例古人类全基因组的深度序列测序和解读给我们带来的惊人成果。这一历史性成果以封面故事发表在2010年2月11日出版的科学期刊《Nature》上。该项目中所使用的新一代高通量测序技术(NGS)与传统学科相结合体现出的强大的科学价值,使科学家可以从微量遗迹中获得更多的遗传学信息,更加详实地揭示生物界进化过程中的关键步骤以及进化机制,更加精准地提取痕量DNA进行个体识别与画像,让更多的“死人死物”“开口说话”。

  二、DNA双螺旋、遗传标记与法医遗传学:交融的进化史

  EskeWillerslev教授和他的研究伙伴们能够精确绘制来自四千年前的人类“照片”、推断出他的种族及与其他种族的亲缘,关键在于通过NGS平台破译出的DNA遗传信息足够“牵一发而动全身”。那么DNA是如何帮助我们实现这一切的呢?1953年4月25日,年轻的英国科学家克里克和他25岁的美国同事沃森合作在《Nature》上公开了他们的DNA双螺旋模型,在双螺旋的两部分之间,由四种化学物质组成的碱基对扁平环连结着,并指出生命与遗传的奥秘可能就存在于DNA分子的碱基排列顺序中。

  关于遗传奥秘的思考和探究古来有之。早在大约公元前410年,古希腊哲学家、医学之父希波克拉底提出了遗传学史上的三个重要观念:1.遗传有物质基础,而且是以看不见的颗粒形式(“种子”)传递的;2.泛生论,即认为身体的每个部位都提供了遗传颗粒,遗传物质来自于整个肉体;3.后天获得性能够遗传(科学的不断发展验证了这些观念,颗粒性遗传是正确的,而泛生论和后天获得性遗传都是错误的)。回顾司法鉴定历史,我国先人用血、骨和朴素的遗传学思想率先做出司法亲权鉴定的尝试:三国时代古籍已载有滴骨验亲的事例,宋代法医学家宋慈在世界第一部系统的法医学专著《洗冤集录》中收录了滴骨验亲法,“亲生则血沁入骸骨,否则不入”;明代后有人应用“合血法”鉴定亲权关系,即活人之间的亲权鉴定。合血法较滴骨法更接近现代的血型检验,但也不是科学的方法,不过两种方法在法医学史和医学史上仍具有相当重要的价值。1900年,奥地利科学家发现ABO血型后经过20多年的研究和发展,西方才形成利用ABO、MN、Rh三个血型系统来进行假父排除的系统方法,因此有日本法医学者认为,中国知道以血型鉴定亲权要比欧美早约1400余年。

  DNA双螺旋的发现帮助遗传学与法医学实现了重大进步。20世纪70年代中期,遗传学家们发现了基因组DNA在限制性内切酶作用下,会产生大小不等的DNA片段,并将这种现象命名为限制性片段长度多态性(RFLP),即第一代人类遗传分子标记。1985年,英国遗传学家Jeffreys利用RFLP和Southern印迹法结合发现DNA指纹图,帮助英国警方侦破连续强奸案,成为DNA指纹进行法医个体识别的开端;同年,他在一桩移民案件中通过DNA指纹方法,完全超越了传统血型检验父亲死亡就没办法进行儿子亲缘关系确定的局限,成功帮助一名被移民局怀疑篡改国籍的男孩在其母亲和兄姐基因组中找到亲缘关系证据,告倒了英国移民局。此次检测也成为法医史上第一次真正意义的DNA司法亲权鉴定。

  在DNA测序技术方面,1977年英国科学家Frederick Sanger采用以他本人名字命名的双脱氧终止测序法——“Sanger测序法”进行了人类历史上第一个基因序列——Φ-X174噬菌体(Phage Φ-X174)的测定。另一个重磅消息是Kary Mullis发现并于1985年申请了PCR(Polymerase Chain Reaction,链式聚合酶反应)专利,再加上第二代遗传标记STR(短串联重复序列,short tandem repeats,STR)的横空出世,三者结合产生的STR分型检测技术在毛细管电泳仪加持下,因为其快速、简便、灵敏、数字分型等优势全面淘汰DNA指纹技术,成为亲权鉴定的金标准。虽然STR与第三代遗传标记SNP(单核甘酸多态性,single nucleotide polymorphism, SNP)相比较,不如SNP能提供更全面的基因信息,但是STR还是以其独特的优点保存下来,成为法医DNA鉴定中最为常用的遗传标记,目前常染色体STR复合荧光多重PCR分型技术仍然是国际法医学界不可或缺的、公认的重要亲权鉴定技术手段。

  人类遗传标记的先后面世和Sanger测序技术、毛细管电泳技术(Capillary electrophoresis,CE)的成功运用,使科学家们开始思考人类基因组测序的重要性和可行性。历经6年的酝酿和反复论证,美国在1990年10月1日率先启动人类基因组计划(human genome project, HGP)。HGP是第一个有发展中国家(中国)参与的大型国际科研项目,计划在2005年把人体内约2.5万个基因的密码全部解开,同时绘制出人类基因的图谱。其任务之巨量对于当时的技术水平来说基本是无法按计划完成的,但项目的设计者不但坚信项目可以保质保量完成,并且非常天才地认为在如此巨额的投资刺激下,肯定会激发全社会对测序技术改进、新仪器发明的热情和投入(虽然很多人觉得该论点过于乐观)。不过事实证明他们的远见卓识,HGP不仅解开人体内约2.5万个基因的遗传密码,还催生出自动化毛细管电泳仪、新一代测序(Next Generation Sequencing,NGS)等大批新事物和新技术,顺利帮助整个项目提前了两年完成。从此测序技术进入大规模平行高通量测序时代,也给由PCR-CE-STR技术全面统治的法医遗传学带来新的发展契机。

  三、NGS测序平台与法医遗传学应用:新技术、新开始

  NGS技术也被称为大规模平行测序技术、第二代测序技术,以能一次并行对几十万到几百万条DNA分子进行序列测定和一般读长较短等为标志,它的出现克服了第一代测序技术成本高、通量低及对人力需求大等缺陷,与传统测序技术相比,NGS测序从测序原理、测序过程、适用范围及测序结果都存在本质的不同,给生物学领域带来新的突破,对法医遗传学也带来新的冲击和挑战。

  对于经典的遗传标记STR的检测方面,二代测序平台较PCR-CE平台具有显著优势。首先二代测序平台可明确分辨DNA序列,精细展示出STR等位基因重复单元等的真实情况;其次二代测序在微量、降解检材方面的分辨率更好,扩增效率更高,测序深度更深。在第三代人类遗传标记SNP检测方面,在NGS技术成熟之前,虽然SNP可提供比STR更丰富、更稳定的遗传信息,但在PCR-CE平台上受制于测序深度和成本,未能将其优势发扬光大。如今使用NGS平台进行高通量测序可充分发挥SNP的优越性。常用的SNP遗传标记包括高密度的身份信息、先祖信息、表型信息以及连锁信息(针对父系连锁关系的Y染色体和针对母系连锁关系的线粒体基因组)都得到充分的研发和应用,可帮助司法部门从无名尸体中取得关键线索,或判定同卵双胞胎中到底哪一个是真正的犯罪嫌疑人,甚至如前文所述给古人类外貌和地域来源进行精准描述。

  另外,对于数量有限或者质量不佳的生物样本,DNA检测成功率低是困扰法医遗传学工作者的普遍问题。NGS技术因为测序位点多,分辨率高,可取得比PCR-CE平台更好的实验效果。同样地,可采用二代测序平台进行SNP位点检测,因SNP在降解样品上扩增子片段可以小至数十个片段,比需要更大DNA片段的STR位点检测效果更好。

  基于以上突出优势和行业需求,全球各大测序仪制造厂商在现有基础上分别推出了专门针对法医领域的NGS测序平台,目前较为成熟的平台有美国Thermo Fisher公司基于半导体测序技术的Ion PGMTM测序平台和美国Illumina公司基于边合成边测序技术的Miseq-FGxTM测序平台。

  我国作为第一个参与国际性科研项目的发展中国家,成功完成了人类基因组计划的1%,在基因组科学及基因组研发应用领域基本保持与国际同步,国内基于NGS技术的医学基因组学、法医基因组学应用研发蓬勃发展。2016年12月18日,深圳华大基因集团在成熟的NGS测序平台BGIseq-500基础上结合法医测序技术特点,推出我国第一台具有自主知识产权的高通量测序法医专用机FGI5500,并与西安交通大学法医学院合作开发相关配套试剂与技术方案。

  上述平台可以进行适用于微量、高降解度检材和复杂亲缘关系辅助鉴定的人类身份鉴定,也可以进行祖先或地域溯源推断实验,可以在没有嫌疑人或现有DNA数据库未能比中的情况下,通过推断始祖信息或表型信息来为案件侦查提供更多线索。另外利用NGS平台通过抽取母亲的外周血,在孕早期(6-7周)测定胎儿的生父、制作个性化的包含白细胞HLA分型、耐药基因等用于急救医疗及骨髓、干细胞移植的DNA身份档案等,目前也已经形成商品化的解决方案。

  四、而今迈步从头越——总结和展望

  越来越多的学者认为,NGS技术的诞生是基因组研究领域一个具有里程碑意义的事件。诚然,NGS技术带来的高分辨率和测序成本下降确实改变了我们每个人的生活。2014年,《自然》杂志预言个人基因组测序将整体进入千(美)元时代;如今,以天津这个我们每天生活的城市为例,人们可以用几百元的价格为新生儿进行先天性耳聋基因组或遗传代谢病的基因检测;孕妇们通过无创产前基因检测技术预测自己的宝宝是否存在染色体异常;父母为宝宝购置一份终身保存的基因档案,科学防走失;用NGS技术检测人乳头病毒预防宫颈癌,或者通过基因检测的方式有针对性地指导肿瘤用药等等例子俯拾皆是。然而与医学基因组学异常火爆、甚至大有将传统血清学检测取而代之的情况有所不同的是,NGS技术在法医领域的全面推进相对较为坎坷。究其原因,STR技术是当前法医DNA领域的主流技术、NGS技术成本高、NGS技术在法庭科学应用领域尚未形成统一的技术标准等问题依然影响NGS技术的全面普及和推进。

  尽管NGS在法庭科学应用领域受上述问题困扰,还没有完全发挥它的优势,但随着案件样本的复杂性、多样性增高,传统的STR位点势必无法完全满足实际应用的需求。我们相信,NGS技术完全有可能从之前无法想象的微量样本、破坏极其严重的生物检材中挖掘出案件侦破所需要的全部遗传学信息,如一些公安战线的遗传学研究者来说,“具有无可比拟的吸引力”。NGS技术同样可应用于法庭科学相关的动植物、微生物鉴定、反恐维稳、食品安全、濒危物种保护等等。我们期待着NGS技术如当年生动描绘4000年前的古格陵兰人“照片”一般,借助新技术的慧眼,解开谜题、还原真相,并随着大数据时代的到来,更精准地服务于法庭鉴证需求,维护社会公平正义,守卫人民生活幸福安全。

 
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